Микроскопические методы исследования — способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине этими методами изучают строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу микроскопических методов исследования составляют СМ и ЭМ. СМ имеет несколько разновидностей, каждая из которых использует различные свойства света: фазово-контрастная, интерференционная, люминесцентная, поляризационная, стереоскопическая, ультрафиолетовая, инфракрасная. В ЭМ изображение объектов исследования возникает в результате направленного потока электронов. СМ основывается на таких определяющих факторах, как разрешающая способность микроскопа, направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света — его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. Для СМ биологические объекты обычно окрашивают для выявления тех или иных их свойств. При этом ткани должны быть фиксированы, так как окраска выявляет определённые структуры только погибших клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает клеточные структуры. Тем не менее в СМ можно изучать и живые биологические объекты (витальная микроскопия).В этом случае применяют тёмнопольный конденсор.
Фазово-контрастная микроскопия применяется для исследования живых и неокрашенных биологических объектов. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта изучения, от которых зависит изменение длины и фазы световой волны. В патологии фазово-контрастная микроскопия находит применение при исследовании простейших, клеток растений и животных, при подсчёте и дифференцировке клеток костного мозга и периферической крови, при изучении клеток культуры тканей и др.
Поляризационная микроскопия позволяет изучать биологические объекты в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете. Этого достигают с помощью плёнчатых поляроидов или призм Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные и оптически разнородные структуры. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, а в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях — отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным лучепреломлением. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера лучепреломления поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры. Поляризационная микроскопия является одним из гистологических, а также цитологических методов исследования, способом микробиологической диагностики и др. Важно, что в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные (нативные) срезы тканей.
Люминесцентная микроскопия основана на свойстве многих веществ давать свечение — люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра света. Ряд биологических веществ, таких как простые белки, коферменты, некоторые витамины, лекарственные средства (ЛС) обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться при добавлении к ним специальных красителей — флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно, но могут избирательно окрашивать отдельные клеточные структуры или определённые химические соединения. На этом основано использование люминесцентной микроскопии в цитологических и гистохимических исследованиях. Иммунофлюоресценция в люминесцентном микроскопе позволяет выявлять различные Аг и их концентрацию в клетках, при этом возможна идентификация вирусов, определение AT и иммунных комплексов, гормонов, различных продуктов метаболизма и др.Люминесцентную микроскопию применяют для диагностики вирусных инфекций, с помощью вторичной люминесценции диагностируют злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют очаги ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т. д.
Ультрафиолетовая и инфракрасная микроскопия основана на способности поглощения УФ- и инфракрасных лучей определённых длин волн некоторыми веществами, входящими в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных тканей, прозрачных в видимом свете. Свойством поглощать УФ-лучи обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, метилаланин), пуриновые и пиримидиновые основания и др. С помощью УФ-микроскопии изучают локализацию и количество таких веществ, а при исследовании живых объектов — их изменения в процессе жизнедеятельности. Инфракрасная микроскопия применяется в медицине преимущественно в нейроморфологии и офтальмологии.Для специальных целей в патологии используются и другие микроскопические методы — интерференционная, стереоскопическая микроскопия и др.ЭМ применяют для изучения структуры клеток, микроорганизмов и вирусов на субклеточном и макромолекулярном уровнях. Значительную разрешающую способность ЭМ обеспечивает поток электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. При трансмиссионной ЭМ электроны проходят через структуры исследуемого объекта, а при сканирующей ЭМ они отражаются от этих структур, отклоняясь под разными углами. В результате возникает изображение на люминесцирующем экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) ЭМ получают плоскостное изображение внутриклеточных структур, при сканирующей — объёмное. Весьма полезно сочетание ЭМ с другими методами — авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими методами. Возникает возможность наблюдать течение биохимических и иммунологических процессов в клетке в сочетании с изменениями внутриклеточных структур. ЭМ требует специальной химической или физической фиксации тканей. Для исследования берут в основном биопсийный материал. Может быть использован и секционный материал, но в максимально короткие сроки после смерти, обычно исчисляемые минутами. После фиксации ткани обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на ультратомах. При этом получают ультратонкие срезы тканей толщиной 30—50 нм. Их контрастируют, переносят на специальные металлические сетки и затем изучают в ЭМ. При ультратомировании препарата можно получить так называемые полутонкие срезы толщиной 1,5 мкм, которые после окраски метиленовым синим исследуют в СМ. Это позволяет получить представление о состоянии той ткани, клетки которой будут затем изучены в ЭМ. Метод может иметь и самостоятельное значение.В сканирующем (растровом) ЭМ исследуют поверхность биологических и небиологических объектов, напыляя в вакуумной камере на их поверхность электроноплотные вещества и изучая эти реплики, повторяющие контуры объекта исследования. Микроскопические методы используют в медицине в сочетании с гистологическими методами исследования клеток и тканей. Для этого, как правило, фиксированные тканевые срезы должны быть окрашены с целью выявления различных клеточных структур. Последние воспринимают красители в зависимости от их физико-химических свойств. Поэтому красители подразделяют на основные, кислые и нейтральные.Основные, или базофильные, красители являются красящими основаниями или их солями (гематоксилин, метиленовый синий, толуидиновый синий и др.). В цветовой гамме этих красителей преобладают оттенки синего цвета. Интенсивность окраски (базофилия) зависит от числа кислотных групп в структурах клетки, способных взаимодействовать с основными красителями. Кислые, или ацидофильные, красители — красящие кислоты или их соли, окрашивающие клеточные структуры в различные оттенки красного (эозин, эритрозин, Конго красный, оранж и др.). Нейтральные, красители содержат и базофильные, и ацидофильные вещества (например, смесь Романовского—Гимзы). Такие красители могут обладать способностью растворяться в определённых веществах, окрашивая их (судан III, шарлах и др.). Нередко для контрастирования структур клеток или тканей используют методы, основанные на способности этих тканей удерживать или восстанавливать соли тяжёлых металлов (серебра, золота, осмия, свинца и др.). Эти методы контрастирования называются импрегнацией, они используются как в СМ, так и в ЭМ.С помощью различных красителей в повседневной и научной практике применяют обзорные окраски для составления общего представления о состоянии исследуемой ткани (гематоксилин и эозин, азур-фукселин и др.), а также специальные окраски для выявления особенностей процессов, протекающих в тканях и клетках. Так, используют окраску Суданом III для выявления жировой дистрофии клеток, Конго красным — для определения отложений амилоида, импрегнацию серебром — для исследования нервной ткани и т.п. Живые и неокрашенные объекты исследуют с помощью специальных микроскопических методов, описанных выше.Гистохимические и гистоферментохимические методы позволяют проследить и оценить обмен веществ в тканях и клетках в норме и вусловиях патологии; избирательно оценить метаболизм белков, липидов, углеводов и других метаболитов, локализацию и активность ферментов и гормонов, проанализировать особенности окислительно-восстановительных процессов, протекающих в клетках и тканях в условиях патологии, при приспособлении и компенсации. Диапазон применения гистохимических методов в патологии необычайно широк. Для гистохимических исследований используют срезы свежезамороженных тканей, приготовленные в криостате, что позволяет сохранить прижизненную локализацию того или иного химического соединения. Гистохимические методы часто сочетают с другими методами СМ и ЭМ. Для количественной оценки результатов гистохимических реакций применяют гистофотометрию, цитофотометрию, микрофлюорометрию и др.